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rapd标记法鉴定中药黄精及长梗黄精的研究

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日期:2015-9-9 21:37:15
1.1.2  仪器万能研究显微镜(olypus wvanox);tgl-16g型台式高速离心机(上海医用分析仪器厂);hh-42型快速恒温数显水箱 (常州国华电器有限公司);uv-240 紫外分光光度仪(shimadzu公司);2400型pcr仪(geneamp公司)。凝胶电泳仪(dyy-ⅲ33a型,北京市六一仪器厂)。
1.1.3  材料材料采自天津、河北省、江西省和北京植物园等地。材料来源见表1。
2  方法
2.1  显微鉴定截取1~2 cm3的根茎,置于f.a.a固定液中固定24 h。取出后经一系列浓度的乙醇脱水,石蜡包埋,切片厚度确定为15 μm。用1%番红、2%淡绿染色24 h,中性树胶封片,拍照(横切放大倍数100×,针晶放大倍数400×)。
2.2  提取样品的dna取0.1 g植物根茎置于-80 ℃预冻40  min,待药材充分变硬、变脆,置于白瓷乳钵研磨,加入ctab提取液(含2%二巯基乙醇),于65 ℃消化60 min,不断振荡,充分反应,加入等体积chcl3∶异戊醇溶液(24∶1)。13 000 r/min离心5 min,取上层液加入1/10个体积65 ℃预热的 ctab/nacl溶液,加入 chcl3∶异戊醇溶液(24∶1)提取,13 000 r/min离心5 min。取上层相加等体积ctab沉淀液后于65 ℃水浴30 min,5 000 r/min离心10 min,取沉淀加入500 μl高盐te溶液, 混匀,再加入0.6个体积-20 ℃预冷的异丙醇,振摇,12 000 r/min离心15 min,取沉淀,用80%乙醇清洗,挥干,用te(10,1)溶解,得dna储备液。将储备液稀释成5 ng·μl-1的模板dna,置于-20 ℃备用。
2.3  引物筛选及rapd分析[3~5]选取23条随机引物,分别放入反应体系并按照下列比例,加入其它组分,其中模板dna浓度为5 ng/μl。
rapd扩增反应总体积为25.2 μl:5 μl 5 ng/μl模板dna,2.5 μl 10 μmol/l引物,2.5 μl各为2.5 mmol/l dntps,2.5 μl pcr缓冲液,3 μl 25 mmol/l mgcl2,0.2 μl taq酶、9.5 μl高压水,混匀,扩增。扩增程序:第1阶段,预变性94℃,3 min;第2阶段,每个循环94℃变性1min,37℃退火1 min,72℃延伸2 min,共40个循环;第3阶段,72℃继续延伸4 min;4℃储存。
配制1.8%琼脂糖凝胶(含eb),在1×tae缓冲液中电泳,电泳电压70v,凝胶成像分析系统拍照。选取扩增效果较好的引物用作最终的分析。
2.4  显微鉴定结果长梗黄精与黄精、多花黄精的显微特征极为相近,中柱维管束多为周木型或不完全周木型,少见外韧型。所采植物粘液细胞的大小、多少以及针晶束的大小,多少随种类、采集地点的不同而改变。可采用显微鉴定对其进行大体上的区分,然后从分子水平上对其差异进行研究。见图1~2。
2.5   rapd扩增图谱通过多次重复实验,选取结果稳定、重现性好的序列ctggggctga,gctggctgac,tcccgaaccg作为rapd分析的引物。见图3。
用引物tcccgaaccg扩增,在1000~2000bp,长梗黄精没有谱带,江西产多花黄精有一条谱带,贵州产多花黄精有两条谱带,可以区分多花黄精与长梗黄精,同时江西与贵州产多花黄精谱带不同,很可能存在种内分化。用引物ctggggctga扩增,在250~500bp,黄精得到1条谱带,长梗黄精得到2条谱带,可作为鉴别黄精与长梗黄精的依据。用引物gctggctgac扩增,黄精与多花黄精、长梗黄精谱带位置和数目仍然不同,可作为区分所采样品黄精、多花黄精与长梗黄精的分子生物学依据。


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